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    關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),這幾點(diǎn)必須要清楚

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-25  點(diǎn)擊次數(shù): 1971次

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子如 DNA RNA 等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

        瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色體中,因此一個(gè)宿主細(xì)胞可存在多個(gè)拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達(dá),但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動(dòng)子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說,超螺旋質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后 24-72 h 內(nèi)分析結(jié)果,常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

        穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指外源 DNA 既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線性 DNA 比超螺旋 DNA 轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色體中概率很小,通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。


    主要有下面幾種方法:

    化學(xué)法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法;物理法:電穿孔法、顯微注射法、biolistic 顆粒傳遞法;病毒介導(dǎo)法:逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒

    A. 陽離子脂質(zhì)體法:

        帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。過程如下圖:

    圖片

       特點(diǎn):

        簡單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時(shí)需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法。

    B. 電穿孔法:

        利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾,使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔。

    C. 逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA):

        通過病毒中膜糖蛋白和宿主細(xì)胞表面的受體相互作用進(jìn)入宿主細(xì)胞,之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)合成 DNA 并隨機(jī)整合到宿主基因組中。

        特點(diǎn):穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、原代細(xì)胞,體內(nèi)細(xì)胞等,但攜帶基因不能太大。

    D. 腺病毒(雙鏈 DNA):

        先和細(xì)胞表面的受體結(jié)合,繼而在αV 整合素介導(dǎo)下被細(xì)胞內(nèi)吞。

        特點(diǎn):可用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。

    圖片


        影響轉(zhuǎn)染的因素:

        血清 血清影響復(fù)合物的形成,降低轉(zhuǎn)染效率

        陽離子脂質(zhì)體和 DNA 的最佳量在使用血清時(shí)會(huì)有所不同,因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時(shí)要進(jìn)行條件優(yōu)化。大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個(gè)小時(shí)內(nèi)保持健康,對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,可以使用 OPTI-MEM I 培養(yǎng)基。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,建議使用 LIPOFECTAMINE 2000。

        抗生素

        比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。

        細(xì)胞代數(shù)

        轉(zhuǎn)染前細(xì)胞最好經(jīng)過 1-2 次傳代保證細(xì)胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染,注意貼壁細(xì)胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染。

        細(xì)胞鋪板密度

        一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為 70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為 2*10^6--4*10^6 細(xì)胞/ml 時(shí)效果較好。確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。

        DNA 質(zhì)量

        DNA 質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理,如果 DNA 不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會(huì)顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進(jìn)行。

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