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    RNA Trizol 抽提步驟

    發(fā)布時間: 2021-08-30  點擊次數: 1327次

    PCR、qRT-PCR 最最初始,都離不開 RNA 的抽提,RNA 質量的好壞,直接影響到后續(xù)的反轉錄及 PCR 等過程。很多時候,小伙伴們明明跟著 Trizol 步驟一步一步來的,謹小慎微,不敢懈怠,但就是 RNA 抽提不過關。其實 Trizol 抽提 RNA 是個細活兒,小伙伴們根據自身的實戰(zhàn)經驗,做一下優(yōu)化很有必要~ 


    Trizol 標準抽提步驟(打勾勾的自然是要注意的地方): 

    1、將裂解后樣品或勻漿液室溫放置 5-10 min,使得核蛋白與核酸*分離。 

    ?樣品中如含有較多的蛋白質、多糖、脂肪或其他細胞外基質,可以 12,000  rpm 離心 10 min,移去漂浮的油脂,取上清。 

    2、加入 0.2 ml 氯仿,劇烈振蕩 15 sec,室溫放置 3 min。12,000 rpm 4°C 離心 10 min。 

    ?如不能旋渦混勻,可手動顛倒混勻 2 min。 

    ?樣品會分成三層:上層水相,中間層和下層有機相。RNA 在上層水相中。 

    3、吸取上層水相轉移至干凈的離心管中,加入等體積異丙醇,混勻,室溫放置 20 min。 

    ?不要吸取任何中間層物質,否則會出現染色體 DNA 污染。 

    4、12,000rpm 4°C 離心 10 min,棄上清。

    ?離心前 RNA 沉淀通常是不可見的,離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。 

    5、加入 1 ml 75%乙醇洗滌沉淀。12,000 rpm 4°C 離心 3 min,棄上清。室溫干燥 5-10 min。 

    ?75%乙醇用 DEPC 處理過的水配制。 

    ?通常 1 ml Total RNA Extractor 需用 1 ml 75%乙醇洗滌沉淀。 

    ?不要倒出沉淀,剩余少量液體短暫離心,然后用槍頭吸出,不要吸沉淀。 

    ?不要晾的過干,RNA *干燥后很難溶解,大約晾干 5 min 左右。 

    6、加入 30-50 µl RNase-free ddH2O,充分溶解 RNA。將所得到的 RNA 溶液置于 -70°C 保存或用于后續(xù)試驗。 

    ?對于肝、胰腺、腎等組織中 RNase 含量很高,沉淀用 100%去離子甲酰胺溶解。


    額外的小 TIP~(第三步): 

    很多剛開始學抽提的小伙伴吸取上層水相總是吸到中間層物質。既然吸上層手容易抖,那不妨吸下層遺棄然后把剩余的再進行離心。這樣多一步,離完心剩下的基本就是上層水相和中間層沉淀,再吸取想要的目標就能輕松改掉手抖啦~ 


    Protocal 改善的地方~(還是第三步):

    3、吸取上層水相轉移至干凈的離心管中,加入 2.5 倍體積乙醇,1/10 倍體積 3M 醋酸鈉,以及糖原。混勻,-80°C 放置 30-60min。

    ?不要吸取任何中間層物質,否則會出現染色體 DNA 污染。 

    ?加入糖原,使溶液中糖原的最終濃度達到 50ng/µl。 

    ?混勻后,-80°C 放置 30 -60min,適當增長孵育時間或者降低孵育溫度將有助于小 RNA 的沉降。 

    ?以取 500µl 上層水相為例,則需加入 1250µl 乙醇,50µl 醋酸鈉以及 4.5µl 糖原原液(原液濃度為:20mg/ml)。

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